献给初学者：PCR常见问题分析

4扩展产物出现杂带

可能的原因和对应的解决方案如下：

引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。

循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。

酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。

退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的 PCR 扩增。以 2 度为梯度设计梯度 PCR 反应优化退火温度。

样品处理不当。

Mg2+ 浓度偏高，因适当调整 Mg2+ 使用浓度。

若为 PCR 试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。

复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。

反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。

引物特异性差。利用 BLAST 检查引物特异性或重新设计引物。

引物量过多。减少反应体系中引物的用量。

模板量过多。质粒 DNA 的用量应<50 ng，而基因组 DNA 则应<200 ng。

外源 DNA 污染。确保操作的洁净。

5条带大小与理论不符

可能的原因和对应的解决方案如下：

污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。

模板或引物使用错误。更换引物和模板。

基因亚型。对研究的基因进行序列分析和 BLAST 研究。

6阴性对照出现条带

可能的原因和对应的解决方案如下：

试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。